Molekulárne biologické metódy výskumuhrajú veľkú úlohu v modernej medicíne, kriminalistike a biológii. Vďaka pokroku v oblasti štúdií DNA a RNA je osoba schopná študovať genóm organizmu, identifikovať pôvodcu ochorenia, rozpoznať požadovanú nukleovú kyselinu v zmesi kyselín atď.
Už v 70. a 80. rokoch minulého storočia boli vedcidešifrovať ľudský genóm. Táto udalosť dala impulz vývoju genetického inžinierstva a molekulárnej biológie. Štúdium vlastností DNA a RNA viedlo k skutočnosti, že teraz je možné použiť tieto nukleové kyseliny na diagnostiku ochorenia, na štúdium génov.
Molekulárne biologické metódy diagnostikyvyžadujú prítomnosť východiskového materiálu: často sa nukleové kyseliny. Existuje niekoľko spôsobov, ako vybrať tieto látky z buniek živých organizmov. Každý z nich má svoje výhody a nevýhody, a to je potrebné brať do úvahy pri výbere metódy izolácie nukleových kyselín v čistej forme.
1. Príprava DNA podľa Marmuru.Spôsob spočíva v tom, že sa zmes látok spracuje s alkoholom, v dôsledku čoho sa vyzráža čistá DNA. Nevýhodou tejto metódy je použitie agresívnych látok: fenol a chloroform.
2. Izolácia DNA Boomom.Základnou látkou, ktorá sa tu používa, je guanidíntiokyanát (GuSCN). Podporuje ukladanie kyseliny deoxyribonukleovej na špeciálnych substrátoch, z ktorých sa môže následne zbierať so špeciálnym pufrom. Avšak GuSCN je inhibítorom PTC a dokonca aj malá časť, ktorá je zachytená v zrážanej DNA, môže ovplyvniť priebeh polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá hrá dôležitú úlohu pri práci s nukleovými kyselinami.
3. Depozícia nečistôt. Metóda sa líši od predchádzajúcich tým, že nie sú nečistoty, ktoré sú uložené, ale nie samotné molekuly deoxyribonukleovej kyseliny. Aby ste to dosiahli, použite iónové výmenníky. Nevýhodou je, že nie všetky látky sa môžu usadiť.
4. Hromadné skríning. Táto metóda sa používa v prípadoch, keď nepotrebujete presné informácie o zložení molekuly DNA, ale potrebujete získať niektoré štatistické údaje. To je vysvetlené skutočnosťou, že štruktúra nukleovej kyseliny sa môže počas spracovania s detergentmi, najmä so zásadami, poškodiť.
Všetky molekulárne biologické výskumné metódy sú rozdelené do troch veľkých skupín:
1. Amplifikácia (s použitím rôznych enzýmov). To zahŕňa PCR - polymerázovú reťazovú reakciu, ktorá zohráva veľkú úlohu v mnohých diagnostických metódach.
2. Nezosilnenie. Táto skupina metód priamo súvisí s činnosťou zmesí nukleových kyselín. Príkladmi sú 3 typy blotovania, in situ hybridizácia atď.
3. Metódy založené na rozpoznaní signálu molekuly sondy, ktorá sa viaže na špecifickú DNA alebo RNA sondu. Príkladom je hybridizačný systém Hybride Capture System (hc2).
Mnoho molekulárnych diagnostických metód zahŕňa použitie širokého spektra enzýmov. Nasledujúce sú najčastejšie používané:
1. Reštrikčný enzým - "rez" molekula DNA do potrebných častí.
2. DNA polymeráza - syntetizuje molekulu dvojvláknovej deoxyribonukleovej kyseliny.
3. Reverzná transkriptáza (reverzná transkriptáza) - použitá na syntézu DNA na templáte RNA.
4. DNA-ligáza - je zodpovedná za tvorbu fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidmi.
5. Exonukleáza - odstraňuje nukleotidy z koncov molekuly deoxyribonukleovej kyseliny.
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je aktívnapoužívané v modernej molekulárnej biológii. Táto metóda, v ktorej môže byť jedna molekula DNA, získaná veľký počet kópií (amplifikácie molekuly).
Hlavné funkcie PCR:
- diagnostika chorôb;
- klonovanie DNA, génov.
Na vykonanie polymerázovej reťazovej reakcievyžaduje nasledujúce prvky: počiatočné molekula DNA, termostabilné DNA polymerázu (Taq alebo PFU), deoxyribonukleotidy fosfáty (zdroje dusíkových báz), primérov (primer 2 1 molekulu DNA) a pufrovací systém sám, ktorý môže vykonávať všetky reakcie.
PCR pozostáva z troch stupňov: denaturácia, žíhanie primérov a predĺženie.
1. Denaturácia. Pri teplote 94-95 stupňov Celzia dochádza k prerušeniu vodíkových väzieb medzi dvoma reťazcami DNA a v dôsledku toho sa získajú dve jednovláknové molekuly.
2. Žíhanie primérov. Pri teplote 50 až 60 ° C sú priméry pripojené na koncoch jednoreťazcových molekúl nukleovej kyseliny typu komplementarity.
3. Predĺženie. Pri teplote 72 stupňov nastáva syntéza dcérskych dvojvláknových molekúl deoxyribonukleovej kyseliny.
Molekulárne biologické výskumné metódyčasto vyžadujú znalosť sekvencie nukleotidov v molekule deoxyribonukleovej kyseliny. Sekvenovanie sa vykonáva na určenie genetického kódu. Molekulárna diagnostika budúcnosti bude založená na poznatkoch získaných pri určovaní poradia osoby.
Nasledujúce typy sekvencií sú rozlíšené:
